Las salas del 25 al 34 albergan las obras maestras del siglo XVI.

Sala 25 Miguel Angel (Tondo Doni) y maestros florentinos
Comienza con la sala 25 de Miguel Ángel y los florentinos, con la obra maestra absoluta de Tondo Doni de Miguel Ángel, altamente innovadora tanto para la composición como para el uso de los colores (1504), rodeada de obras florentinas de la escuela de San Marco (Fra ‘ Bartolomeo, Mariotto Albertinelli), desde la tranquila y secular monumentalidad que inspiró a Buonarroti y al propio Raffaello.

Sala 26 Rafael y Andrea del Sarto
Sala 27 Pontormo y Rosso Fiorentino
Las salas 26 y 27, respectivamente dedicadas a Raffaello / Andrea del Sarto y Pontormo / Rosso Fiorentino, son las reordenaciones después de que sus obras hayan sido transferidas a las salas más grandes en el primer piso («salas rojas»).

Sala 28 Tiziano y Sebastiano del Piombo
La habitación 28 alberga las obras maestras de la escuela veneciana de Tiziano y Sebastiano del Piombo. El primero se refiere a una serie de retratos y desnudos, que incluyen la famosa Flora y la Venus de Urbino, obras de sensualidad refinada y enigmática.

Habitación 29 Parmigianino y Dosso Dossi
Sala 30 Escuela de Emilia de Cinquecento
En las salas 29 y 30 hay obras maestras de pintores emilianos, entre ellos Dosso Dossi, Amico Aspertini, Ludovico Mazzolino, Garofalo y, sobre todo, Parmigianino, cuya madonna de cuello largo muestra con virtuosismo la superación de los cánones estéticos renacentistas en favor de algo más excéntrico y antinatural, con una ambigüedad compleja y ciertamente deseada, así como sinuosamente hermosa.

Habitación 31 Veronés
Sala 32 Bassano y Tintoretto
Las salas 31 y 32 están vinculadas de nuevo con pintores venecianos, en particular, Veronese, Tintoretto, Bassano, Paris Bordon y otros. Debido a su forma estrecha y quebrada, la sala 33 se ha configurado como el «Corredor del siglo XVI», dedicada a obras medianas y pequeñas que muestran la variedad de propuestas figurativas elaboradas en el siglo: desde composiciones multitudinarias y minuciosamente cautivadoras por artistas participaron en la decoración del estudio de Francesco I en el Palazzo Vecchio, los refinamientos eróticos de la escuela de Fontainebleau, los retratos oficiales y las obras simplificadas de acuerdo con los dictados de la Contrarreforma.

Sala 33-34 Quinientos Lombard
última sala de la ruta, sala 34, dei Lombardi, donde se representan los principales artistas activos de la región durante todo el siglo XVI. Estos incluyen Lorenzo Lotto, el vínculo entre la cultura veneciana y la cultura lombarda (Retrato de un joven, Susana y los Ancianos, Sagrada Familia y Santos), el bresciano Giovanni Girolamo Savoldo, extraordinario creador de efectos materiales, y el Bergamo Giovan Battista Moroni, retratista sin igual. Entre la sala 34 y la sala 35 hay acceso al Corredor Vasari.

Galería Uffizi

La Galería ocupa por completo el primer y segundo piso del gran edificio construido entre 1560 y 1580 y diseñado por Giorgio Vasari. Es famoso en todo el mundo por sus destacadas colecciones de esculturas y pinturas antiguas (desde la Edad Media hasta el período moderno). Las colecciones de pinturas del siglo XIV y el Renacimiento incluyen algunas obras maestras absolutas: Giotto, Simone Martini, Piero della Francesca, Beato Angelico, Filippo Lippi, Botticelli, Mantegna, Correggio, Leonardo, Raffaello, Miguel Ángel y Caravaggio, además de muchos obras preciosas de pintores europeos (principalmente alemanes, holandeses y flamencos).

Además, la Galería cuenta con una colección invaluable de estatuas y bustos antiguos de la familia Medici, que adorna los corredores y consta de copias romanas antiguas de esculturas griegas perdidas.