化学では、分光光度法は、材料の反射または透過特性を波長の関数として定量的に測定するものです。 分光光度計は、可視光、近紫外および近赤外を扱うが、時間分解分光技術は対象としないという点で、一般的な用語である電磁分光法よりも特異的である。
概要
分光光度法は、着色した化合物がどれだけの光を吸収するかに依存して、分子の定量分析に依存するツールです。 分光光度計は、色（波長）の関数として光線の強度を測定することができる分光光度計として知られる光度計を使用する。 分光光度計の重要な特徴は、スペクトル帯域幅（試験サンプルを透過できる色の範囲）、サンプル透過の割合、サンプル吸収の対数範囲、時には反射率測定のパーセンテージです。
分光光度計は、溶液、透過ガラスまたは不透明固体、例えば研磨されたガラスまたは気体の透過率または反射率の測定に一般的に使用される。 多くの生化学物質は、可視光を吸収するので、比色分析法によって測定することができるが、無色の生化学物質でさえ、発色性発色反応に適した発色化合物に変換して比色分析に適した化合物を得ることができる。 しかしながら、これらは、異なる制御および較正を使用して、通常約200nm〜2500nmをカバーする列挙された光範囲のいずれかの拡散率を測定するように設計することもできる。 これらの光の範囲内では、測光測定の波長に応じてタイプが異なる基準を使用して、較正が機械上で必要とされる。
分光光度法が用いられる実験の例は、溶液の平衡定数の決定である。 溶液中の特定の化学反応は、反応物が生成物を生成し、生成物が反応物に分解する順方向および逆方向に生じ得る。 ある時点で、この化学反応は平衡点と呼ばれる平衡点に達する。 この時点での反応物および生成物のそれぞれの濃度を決定するために、溶液の光透過率を分光光度法を用いて試験することができる。 溶液を通過する光の量は、光が通過しない特定の化学物質の濃度を示す。
光の吸収は、光が分子の電子モードおよび振動モードと相互作用するためである。 各タイプの分子は、その化学結合および核の構成に関連するエネルギーレベルの個々のセットを有し、したがって特定の波長またはエネルギーの光を吸収し、固有のスペクトル特性をもたらす。 これはその特定の独特なメーキャップに基づいています。
分光光度計の使用は、物理学、材料科学、化学、生化学、分子生物学などのさまざまな科学分野にわたっています。 それらは、半導体、レーザーおよび光学製造、印刷および法医学検査、ならびに化学物質研究のための実験室などの多くの産業で広く使用されている。 分光光度法は、酵素活性の測定、タンパク質濃度の決定、酵素的速度定数の決定、およびリガンド結合反応の測定にしばしば用いられる。 最終的に、分光光度計は、制御または較正に応じて、どの物質がターゲット内に存在するか、および観測された波長の計算を正確にどの程度行うかを決定することができる。
天文学では、分光光度という用語は、スペクトルのフラックススケールが、通常は分光光度標準星の観測と比較して波長の関数として較正され、吸収について補正された天体のスペクトルの測定を指す地球大気による光の
歴史
1940年までにいくつかの分光光度計が市販されていましたが、初期のモデルでは紫外線では機能しませんでした。 Arnold O. Beckmanは、National Technical Laboratories Company、その後のBeckman Instrument Company、そして最終的にはBeckman Coulterで改良版を開発しました。 モデルA、B、Cが開発され（モデルCの3つのユニットが生産された）、モデルDがDUになりました。 すべての電子機器は計器ケースに収納されていましたが、それには紫外線連続体を備えた新しい水素ランプとより優れたモノクロメータがありました。 この楽器は、1941年から1976年まで、本質的に同じデザインで製作されました。 3万人以上が売られた。 1941年の価格は723米ドルでした（遠赤外線アクセサリーは追加費用でオプションになりました）。 ノーベル化学賞受賞者のBruce Merrifield氏は、「これはおそらく、バイオサイエンスの進歩に向けて開発された最も重要な手段だろう」と語った。
設計
装置には2つの主要な種類があります：シングルビームとダブルビーム。 二重ビーム分光光度計は、2つの光路の間の光強度を比較する。一方の経路は基準試料を含み、もう一方の経路は試験試料を含む。 単一ビーム分光光度計は、試験サンプルが挿入される前後のビームの相対光強度を測定する。 ダブルビーム装置からの比較測定はより簡単でより安定していますが、シングルビーム装置はより広いダイナミックレンジを持ち、光学的に簡単でコンパクトです。 さらに、顕微鏡や望遠鏡に組み込まれた分光光度計などの特殊な計測器は、実用性のためにシングルビーム計測器です。
歴史的に分光光度計は、回折格子を含むモノクロメータを使用して分析スペクトルを生成します。 格子は移動可能でも固定でもよい。 光電子増倍管やフォトダイオードなどの単一の検出器を使用する場合、検出器が各波長（各「ステップ」に対応する）で光強度を測定できるように、格子を段階的に走査することができる。 電荷結合素子（CCD）またはフォトダイオードアレイ（PDA）のような検出器のアレイも使用することができる。 そのようなシステムでは、格子が固定され、光の各波長の強度がアレイ内の異なる検出器によって測定される。 さらに、最新の中赤外分光光度計は、フーリエ変換技術を使用してスペクトル情報を取得します。 この技術は、フーリエ変換赤外分光と呼ばれている。
透過測定を行う場合、分光光度計は、基準溶液と試験溶液を通過する光の割合を定量的に比較し、次に、2つの信号の強度を電子的に比較し、基準の標準と比較したサンプルの透過率を計算する。 反射率測定のために、分光光度計は、基準試料および試験試料から反射する光の割合を定量的に比較する。 光源ランプからの光は、モノクロメータを通過し、回転プリズムを介して波長の「レインボー」に光を回折し、モノクロメータの出力側の機械的スリットを介してこの回折スペクトルの狭帯域幅を出力する。 これらの帯域幅は、試験サンプルを通して伝送される。 次いで、透過または反射された光のフォトン束密度（通常、1平方メートル当たりのワット数）が、フォトダイオード、電荷結合素子または他の光センサによって測定される。 次に、試験サンプルの各波長の透過率または反射率値を、基準サンプルからの透過値または反射率値と比較する。 ほとんどの計器は線形透過率に対数関数を適用して、測定される化学物質の「濃度」に比例する値であるサンプルの「吸光度」を計算します。
要するに、現代の分光光度計における一連の事象は以下の通りである。
光源はモノクロメーターに照射され、虹に回折され、2つのビームに分割される。 その後、サンプルおよび参照溶液を通してスキャンされる。
入射波長の一部は、サンプルおよび基準から透過されるか、または反射される。
得られた光は、2つのビームの相対強度を比較する光検出器に当たる。
電子回路は、相対電流を線透過率および/または吸光度/濃度値に変換する。
多くの古い分光光度計は、検出器での2つのビームのヌル電流出力のバランスをとるために、「ゼロ調整」として知られている手順で較正する必要があります。 基準物質の送信はベースライン（基準）値として設定されているので、他のすべての物質の送信は最初の「ゼロ化」物質に対して記録されます。 次に、分光光度計は透過率を初期物質に対する試験試料の特定の成分の濃度である「吸光度」に変換する。
生化学における応用
分光光度法は、DNA、RNA、およびタンパク質の単離、酵素の動力学および生化学的分析を含む多くの生化学実験で使用される重要な技術である。 分光光度法の手順の簡単な説明は、着色化合物を含有しないブランク試料の吸光度を、着色化合物を含有する試料と比較することを含む。 この着色は、595nmで測定したクーマシーブリリアントブルーG-250色素のような色素、または420nmで測定したβ-ガラクトシダーゼとONPGとの間に見られる酵素反応（サンプル黄色に変える）のいずれかによって達成することができる。 分光光度計は、光の可視領域（350nm〜800nm）で着色した化合物を測定するために使用されるため、研究対象の物質に関する詳細情報を見つけるために使用することができます。 生化学実験では、化学的および/または物理的特性が選択され、使用される手順は、量、純度、酵素活性など、試料についてのより多くの情報を得るためにその特性に特異的である。分光光度法サンプルの最適な波長吸光度の決定、サンプルの吸光度の最適pHの決定、未知のサンプルの濃度の決定、および様々なサンプルのpKaの決定などの多くの技術のために使用することができる。 分光光度法はまた、タンパク質精製のための有用なプロセスであり、化合物の光学アッセイを作製するための方法として使用することもできる。 分光光度データは、透過率と濃度と吸光度と濃度との間の様々な関係を決定するために、Beer-Lambertの式A = -log 10T =εcl = ODと併せて使用することもできる。 分光光度計は、その色によって化合物の波長を測定するので、色素結合物質を添加して、色変化を受け測定することができる。 各成分の標準溶液の吸収スペクトルを用いて、2成分混合物の濃度を知ることが可能である。 これを行うためには、2つの波長におけるこの混合物の吸光係数および2つの成分の既知の重量を含む溶液の吸光係数を知ることが必要である。 分光光度計は数十年にわたり開発され改良されており、化学者に広く使用されている。 さらに、分光光度計は、UVまたは可視光の波長吸光度値を測定するために特化されています。 それは非常に敏感で、したがって非常に正確で、特に色の変化を決定する際に非常に正確な器具であると考えられます。 この方法は、安価で比較的簡単なプロセスであるため、実験室実験にも便利です。
紫外可視分光光度計
ほとんどの分光光度計は、スペクトルのUVおよび可視領域で使用され、これらの計測器のいくつかはまた近赤外領域にも作用する。 タンパク質の濃度は、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンの存在に起因する280nmでのODを測定することによって推定することができる。 この方法は、タンパク質の組成が大きく変化し、これらのアミノ酸を含まないタンパク質が280nmで最大吸収を有さないので、あまり正確ではない。 核酸汚染もまた干渉する可能性があります。 この方法は、石英キュベットでUV領域で測定できる分光光度計が必要です。
紫外可視（UV-vis）分光法は、電子遷移を励起するエネルギー準位を含む。 UV-可視光の吸収は、基底状態にある分子を励起状態に励起する
可視領域400-700nm分光光度法は、比色法科学で広く使用されています。 0.2〜0.8 ODのインクメーカー、印刷会社、テキスタイルベンダーなどの多くで、比色測定によって提供されるデータが必要であることは、よく知られています。 彼らは、可視領域に沿って5〜20ナノメートルごとに領域を読み取り、別のプレゼンテーションのための分光反射率曲線またはデータストリームを生成する。 これらの曲線を使用して、新しいバッチの着色剤をテストして、ISO印刷規格などの仕様に一致するかどうかを確認できます。
従来の可視領域分光光度計は、着色剤または基材が蛍光を有するかどうかを検出することができない。 これは、例えば、1つ以上の印刷インクが蛍光性である場合に、色の問題を管理することを困難にし得る。 着色剤が蛍光を含む場合、二分光蛍光分光光度計が使用される。 視覚スペクトル分光光度計には、d / 8（球形）と0/45の2つの主要な設定があります。 名前は光源、観察者、測定室の内部の形状によるものです。 科学者は、この機器を使用して、サンプル中の化合物の量を測定する。 化合物がより濃縮されていれば、より多くの光が試料に吸収される。 小さな範囲内では、Beer-Lambertの法則が成り立ち、試料間の吸光度は直線的に濃度とともに変化する。 印刷測定の場合、用紙ストック内のUV光沢剤の効果をより良く制御するために、uvフィルタを使用せずに/ UVフィルタを使用する2つの代替設定が一般的に使用されます。
試料は通常キュベットで調製される。 関心領域に応じて、ガラス、プラスチック（関心のある可視スペクトル領域）、または石英（関心のある遠紫外線スペクトル領域）で構成することができる。
アプリケーション
溶存有機炭素濃度の推定
芳香族性のメトリックに対する特定の紫外線吸光度
ペントース濃度のバイアル試験
実験的応用
アプリケーションのセクションで説明したように、分光測光法は、DNA、RNA、およびタンパク質の定性および定量分析の両方で使用できます。 定性分析を使用することができ、分光光度計を使用して、各波長における化合物の吸光特性（色の強度）を決定するために広い波長領域を走査することによって化合物のスペクトルを記録する。 可視分光光度計が有し得る様々な用途を実証することができる1つの実験は、様々なタンパク質の混合物からのβ-ガラクトシダーゼの分離である。 概して、分光光度法は、サンプルが全タンパク質濃度に対して行われた精製の量を定量化するのに役立ちます。 アフィニティークロマトグラフィーを実行することにより、B-ガラクトシダーゼを単離することができます。これは、採取したサンプルをONPGと反応させ、サンプルが黄色に変わるかどうかを調べることによって試験できます。 この試験の後、ONPGとの特異的相互作用については420nmでの試料を、ブラッドフォードアッセイについては595での試料について、精製量を定量的に評価することができる。 この分光光度計に加えて、様々なタンパク質サンプルを精製し、単離するために、SDS-Page電気泳動などの他の技術と併用することができる。
赤外分光光度計
赤外領域用に設計された分光光度計は、その領域での測定の技術的要件のために全く異なっています。 1つの主な要因は、異なるスペクトル領域で利用可能なフォトセンサーのタイプですが、赤外線測定は、事実上すべてが熱放射として、特に約5μmを超える波長でIR光を放出するため困難です。
もう1つの問題は、ガラスやプラスチックのようなかなりの物質が赤外光を吸収し、光学媒体として不適合になることです。 理想的な光学材料は、強く吸収しない塩である。 IR分光光度法のための試料は、臭化カリウムの2つのディスク間で塗抹されてもよいし、臭化カリウムで粉砕されてペレットに圧縮されてもよい。 水溶液を測定する場合、不溶性の塩化銀を用いて細胞を構築する。
分光放射計
可視領域分光光度計とほぼ同じように動作する分光放射計は、光源のスペクトル密度を測定するように設計されています。 用途は、製造業者による販売のための照明の評価および分類を含むことができ、または購入すると決めたランプを顧客が確認することは、その仕様内である。 コンポーネント：
光源はサンプル上またはサンプル内を照らします。
試料は光を透過または反射する。
検出器は、試料からどれだけの光が反射されたか、または透過したかを検出します。
次いで、検出器は、試料がどれだけ多くの光を透過または反射したかを数に変換する。