화학에서 분광 광도계는 물질의 반사 또는 투과 특성을 파장의 함수로 정량적으로 측정 한 것입니다. 분광 광도계는 가시 광선, 근 자외선 및 근적외선을 처리하지만 시간 분해 분광 기술은 다루지 않는다는 점에서 일반적인 용어 인 전자기 분광법보다 더 구체적입니다.
개요
분광 광도법은 착색 된 화합물에 의해 얼마나 많은 빛이 흡수되는지에 따라 분자의 정량 분석에 달려있는 도구입니다. 분광 광도계는 분광 광도계 (spectrophotometers)라고하는 광도계를 사용합니다.이 광도계는 색상 (파장)의 함수로 광선의 강도를 측정 할 수 있습니다. 분광 광도계의 중요한 특징은 스펙트럼 대역폭 (테스트 샘플을 통해 전송할 수있는 색 범위), 샘플 전송 비율, 샘플 흡수의 로그 범위 및 때로는 반사율 측정 비율입니다.
분광 광도계는 일반적으로 용액의 투과율 또는 반사율, 연마 된 유리 또는 가스와 같은 투명 또는 불투명 한 고체의 측정에 사용됩니다. 많은 생화학 물질이 가시 광선을 흡수하므로 비색 분석법으로 측정 할 수 있지만 무색 생화학 물질조차도 종종 발색 성 색 형성 반응에 적합한 착색 화합물로 전환되어 비색 분석에 적합한 화합물을 생성 할 수 있습니다. 그러나, 다른 컨트롤과 캘리브레이션을 사용하여 일반적으로 약 200 nm – 2500 nm를 커버하는 나열된 빛 범위 중 어느 곳에서나 확산도를 측정하도록 설계 될 수도 있습니다. 이러한 빛의 범위 내에서 측광 측정의 파장에 따라 유형이 다른 표준을 사용하여 기계에서 보정이 필요합니다.
분광 광도계가 사용되는 실험의 예는 용액의 평형 상수를 결정하는 것입니다. 솔루션 내의 특정 화학 반응은 반응물이 생성물을 형성하고 생성물이 반응물로 분해되는 정방향 및 역방향으로 발생할 수 있습니다. 어느 시점에서이 화학 반응은 평형 점이라는 균형점에 도달합니다. 이 시점에서 반응물 및 생성물의 각각의 농도를 결정하기 위해, 용액의 광 투과율을 분광 광도계를 사용하여 시험 할 수있다. 용액을 통과하는 빛의 양은 빛이 통과하지 못하는 특정 화학 물질의 농도를 나타냅니다.
빛의 흡수는 빛이 분자의 전자 및 진동 모드와 상호 작용하기 때문입니다. 각 유형의 분자는 화학 결합과 핵의 구성과 관련된 에너지 레벨의 개별 세트를 가지며, 따라서 고유 한 스펙트럼 특성을 초래하는 특정 파장 또는 에너지의 빛을 흡수합니다. 이것은 독특하고 독특한 메이크업을 기반으로합니다.
분광 광도계의 사용은 물리학, 재료 과학, 화학, 생화학 및 분자 생물학과 같은 다양한 과학 분야에 걸쳐 있습니다. 반도체, 레이저 및 광학 제조, 인쇄 및 법의학 검사뿐만 아니라 화학 물질 연구를위한 실험실에서 널리 사용됩니다. 분광 광도계는 종종 효소 활성의 측정, 단백질 농도의 결정, 효소의 운동 상수의 결정 및 리간드 결합 반응의 측정에 사용됩니다. 궁극적으로, 분광 광도계는 제어 또는 교정에 따라 타겟에 존재하는 물질과 관찰 된 파장의 계산을 통해 정확히 얼마만큼의 물질을 결정할 수 있습니다.
천문학에서 분광 광도계라는 용어는 스펙트럼의 플럭스 눈금이 분광 광도계 표준 별의 관찰과 비교하여 파장의 함수로 보정되고 흡수에 대해 보정 된 천체의 스펙트럼 측정을 나타냅니다 지구의 대기에 의한 빛의
역사
1940 년까지 여러 가지 분광 광도계가 출시되었지만 초기 모델은 자외선에서는 작동하지 않았습니다. Arnold O. Beckman은 국립 기술 연구소 (National Technical Laboratories Company), 이후 Beckman Instrument Company 및 궁극적으로 Beckman Coulter에서 향상된 버전을 개발했습니다. 모델 A, B 및 C가 개발되었고 (모델 C의 세 가지 단위가 생성되었습니다) 모델 D가 DU가되었습니다. 모든 전자 장치는 계기 케이스에 들어 있었고 자외선 연속체가있는 새로운 수소 램프와 더 우수한 단색 기가있었습니다. 이 악기는 1941 년부터 1976 년까지 본질적으로 같은 디자인으로 제작되었습니다. 30,000 이상 판매되었다. 1941 년 가격은 미화 723 달러였습니다 (원거리 UV 액세서리는 추가 비용으로 옵션이었습니다). 노벨 화학자 인 브루스 메리 필드 (Bruce Merrifield)는 “아마도 생물 과학의 발전으로 발전한 가장 중요한 도구 일 것”이라고 말했다.
디자인
장치의 두 가지 주요 클래스가 있습니다 : 단일 빔 및 이중 빔. 이중 빔 분광 광도계는 기준 샘플을 포함하고 다른 하나는 시험 샘플을 포함하는 2 개의 광 경로 사이의 광 강도를 비교한다. 단일 빔 분광 광도계는 테스트 샘플을 삽입하기 전과 후에 빔의 상대적 광도를 측정합니다. 이중 빔 장비의 비교 측정은 더 쉽고 안정적이지만 단일 빔 장비는 더 큰 다이나믹 레인지를 가질 수 있으며 광학적으로 더 간단하고 콤팩트합니다. 또한 현미경이나 망원경에 내장 된 분광 광도계와 같은 특수 장비는 실용성으로 인해 단일 빔 장비입니다.
역사적으로, 분광 광도계는 분석 스펙트럼을 생성하기 위해 회절 격자를 포함하는 단색화기를 사용합니다. 그레이팅은 움직이거나 고정 될 수 있습니다. 광전관 증 배관이나 포토 다이오드와 같은 단일 검출기를 사용하면 격자가 단계적으로 스캔되어 검출기가 각 파장에서 광도를 측정 할 수 있습니다 (각 “단계”에 해당). 전하 결합 소자 (CCD) 또는 광 다이오드 어레이 (PDA)와 같은 검출기의 어레이가 또한 사용될 수있다. 그러한 시스템에서, 격자는 고정되어 있으며 광의 각 파장의 강도는 어레이 내의 다른 검출기에 의해 측정된다. 또한, 대부분의 현대 적외선 분광 광도계는 스펙트럼 정보를 얻기 위해 푸리에 변환 기술을 사용합니다. 이 기술을 푸리에 변환 적외선 분광법이라고합니다.
투과 측정을 할 때, 분광 광도계는 표준 용액과 시험 용액을 통과하는 빛의 분율을 정량적으로 비교 한 다음 두 신호의 강도를 전자적으로 비교하고 기준 표준과 비교하여 시료의 투과율을 계산합니다. 반사율 측정을 위해 분광 광도계는 기준 샘플과 테스트 샘플에서 반사되는 빛의 비율을 정량적으로 비교합니다. 소스 램프의 빛은 모노 크로 메이터를 통과하여 회전 프리즘을 통해 파장의 “무지개”로 빛을 회절시키고 모노 크로 미터의 출력면에있는 기계 슬릿을 통해이 회절 스펙트럼의 좁은 대역폭을 출력합니다. 이러한 대역폭은 테스트 샘플을 통해 전송됩니다. 그런 다음, 전송되거나 반사 된 빛의 광자 자속 밀도 (보통 미터 제곱미터 당 와트)는 포토 다이오드, 전하 결합 소자 또는 다른 광 센서로 측정됩니다. 시험 샘플의 각 파장에 대한 투과율 또는 반사율 값은 기준 샘플로부터의 투과율 또는 반사율 값과 비교된다. 대부분의 계측기는 선형 투과율에 대수 함수를 적용하여 시료의 ‘흡수율’을 계산합니다.이 값은 측정중인 화학 물질의 ‘농도’에 비례합니다.
요약하면, 현대 분광 광도계의 사건 순서는 다음과 같습니다 :
광원은 단색화 장치에 빛나고 무지개 빛으로 회절되어 두 개의 광선으로 나뉩니다. 그런 다음 샘플 및 참조 솔루션을 통해 스캔됩니다.
입사 파장의 분수는 시료와 기준에서 투과되거나 반사됩니다.
합성 된 빛은 두 개의 빔의 상대적 강도를 비교하는 광 검출기 장치에 도달합니다.
전자 회로는 상대 전류를 선형 투과율 및 / 또는 흡광도 / 농도 값으로 변환합니다.
많은 구식 분광 광도계는 “제로 (zeroing)”로 알려진 절차에 따라 보정 되어야만 검출기에서 두 개의 빔의 널 전류 출력의 균형을 유지해야합니다. 참조 물질의 전송은 기준선 (기준) 값으로 설정되므로 다른 모든 물질의 전송은 초기의 “제로화 된”물질에 상대적으로 기록됩니다. 분광 광도계는 투과율을 초기 물질에 대한 시험 샘플의 특정 성분 농도 인 ‘absorbency’로 변환합니다.
생화학 응용
분광 광도법은 DNA, RNA 및 단백질 분리, 효소 동력학 및 생화학 분석과 관련된 많은 생화학 실험에 사용되는 중요한 기술입니다. 분광 광도계의 절차에 대한 간략한 설명은 착색 된 화합물을 함유하지 않은 블랭크 샘플의 흡광도와 착색 된 화합물을 함유하는 샘플의 흡광도를 비교하는 것을 포함한다. 이 착색은 595 nm에서 측정 된 Coomasie Brilliant Blue G-250 염료와 같은 염료 또는 420 nm에서 측정 된 β- 갈 락토시다 제와 ONPG (표본 황색으로 변함) 사이에 나타나는 효소 반응에 의해 달성 될 수있다. 분광 광도계는 빛의 가시 영역 (350 nm와 800 nm 사이)에있는 착색 된 화합물을 측정하는 데 사용되므로 연구중인 물질에 대한 자세한 정보를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 생화학 실험에서, 화학적 및 / 또는 물리적 특성이 선택되고, 사용되는 절차는 양, 순도, 효소 활성 등과 같은 샘플에 대한 더 많은 정보를 얻기 위해 그 특성에 특유하다. 분광 광도계가 사용될 수있다 시료의 최적 파장 흡광도를 결정하고, 시료의 흡광도에 대한 최적 pH를 결정하고, 미지 시료의 농도를 결정하고, 다양한 시료의 pKa를 결정하는 것과 같은 여러 기법에 대해 설명한다. 분광 광도법은 또한 단백질 정제에 도움이되는 과정이며 또한 화합물의 광학 분석을 만드는 방법으로 사용될 수 있습니다. 분광 광도계 데이터는 투과율과 농도 및 흡광도와 농도 간의 다양한 관계를 결정하기 위해 Beer-Lambert 방정식과 함께 사용할 수도 있습니다 (A = -log10T = εcl = OD). 분광 광도계는 색상을 통해 화합물의 파장을 측정하기 때문에 염료 결합 물질을 첨가하여 색 변화를 측정하고 측정 할 수 있습니다. 각 성분의 표준 용액의 흡수 스펙트럼을 이용하여 2 성분 혼합물의 농도를 알 수 있습니다. 이를 위해서는 2 개의 파장에서이 혼합물의 흡광 계수와 두 성분의 알려진 가중치를 포함하는 용액의 흡광 계수를 알아야합니다. 분광 광도계는 수십 년 동안 개발되고 개선되었으며 화학자들 사이에서 널리 사용되었습니다. 또한 분광 광도계는 UV 또는 가시 광선 파장 흡광도 값을 측정하는 데 특화되어 있습니다. 매우 민감하고 따라서 매우 정확하고 특히 색상 변경을 결정하는 매우 정확한 도구로 간주됩니다. 이 방법은 저렴하고 상대적으로 간단한 과정이기 때문에 실험실 실험에도 사용하기에 편리합니다.
자외선 가시 분광 광도계
대부분의 분광 광도계는 스펙트럼의 자외선 및 가시 광선 영역에서 사용되고 일부는 또한 근적외선 영역에서도 작동합니다. 단백질의 농도는 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌의 존재로 인해 280 nm에서 OD를 측정하여 추정 할 수 있습니다. 이 방법은 단백질의 조성이 매우 다양하고 이들 아미노산이없는 단백질이 280 nm에서 최대 흡수를 갖지 않기 때문에 그다지 정확하지 않습니다. 핵산 오염은 또한 방해 할 수 있습니다. 이 방법은 쿼츠 큐벳으로 UV 영역에서 측정 할 수있는 분광 광도계가 필요합니다.
자외선 – 가시 광선 (UV-vis) 분광학은 전자 전이를 여기시키는 에너지 준위를 포함합니다. UV- 가시 광선의 흡수는 기저 상태에있는 분자를 여기 상태로 여기시킨다.
가시 영역 400-700nm 분광 광도계는 비색계 과학에서 광범위하게 사용됩니다. 0.2-0.8 O.D.의 범위에서 가장 잘 작동한다는 것은 알려진 사실입니다. 잉크 제조업체, 인쇄 회사, 섬유 업체 등은 측색을 통해 제공되는 데이터가 필요합니다. 가시 영역을 따라 5 ~ 20 나노 미터마다 판독 값을 얻고 대안 프리젠 테이션을위한 분광 반사 곡선 또는 데이터 스트림을 생성합니다. 이러한 곡선을 사용하여 새로운 색상 배치 배치를 테스트하여 ISO 인쇄 표준과 같은 사양과 일치하는지 확인할 수 있습니다.
전통적인 가시 영역 분광 광도계는 착색제 또는 기본 물질이 형광을 갖는지 여부를 검출 할 수 없다. 예를 들어 하나 이상의 인쇄 잉크가 형광등 인 경우 색상 문제를 관리하기가 어려울 수 있습니다. 착색제가 형광을 포함하는 경우, 이중 분광 형광 분광 광도계가 사용된다. 시각 스펙트럼 분광 광도계에는 d / 8 (구형)과 0/45의 두 가지 주요 설정이 있습니다. 이름은 광원, 관찰자 및 측정 챔버의 내부 형상에 기인합니다. 과학자들은이 기기를 사용하여 시료에서 화합물의 양을 측정합니다. 화합물이 더 농축되면 더 많은 빛이 시료에 흡수됩니다. 작은 범위 내에서 Beer-Lambert 법칙이 유지되고 샘플 간의 흡광도는 농도에 따라 선형 적으로 변합니다. 인쇄물을 측정하는 경우 두 가지 대체 설정을 일반적으로 사용합니다 .UV 필터를 사용하지 않고 UV 필터를 사용하면 용지 재고 내 UV 광택 기제의 효과를 더 잘 제어 할 수 있습니다.
샘플은 일반적으로 큐벳으로 준비됩니다. 관심 영역에 따라 유리, 플라스틱 (관심있는 가시 스펙트럼 영역) 또는 석영 (관심있는 원 자외선 스펙트럼 영역)으로 구성 될 수 있습니다.
응용 프로그램
용존 유기 탄소 농도 추정
방향족 계량의 특정 자외선 흡수
오색의 집중에 대한 Bial의 테스트
실험적 응용
응용 분야에서 설명한 것처럼 분광 광도계는 DNA, RNA 및 단백질의 정량 분석과 정량 분석에 모두 사용할 수 있습니다. 정성 분석을 사용할 수 있으며 분광 광도계는 각 파장에서 화합물의 흡광도 특성 (색의 강도)을 결정하기 위해 광범위한 파장 영역을 스캔하여 화합물의 스펙트럼을 기록하는 데 사용됩니다. 가시광 분광 광도계가 가질 수있는 다양한 용도를 입증 할 수있는 한 가지 실험은 다양한 단백질의 혼합물로부터 β- 갈 락토시다 아제를 분리하는 것입니다. 일반적으로 분광 광도계는 시료가 총 단백질 농도에 비해 정화 된 양을 정량화하는 데 사용하는 것이 가장 좋습니다. 친화도 크로마토 그래피를 실행하면 B-Galactosidase를 분리 할 수 있으며 수집 된 샘플을 ONPG와 반응시켜 샘플이 노란색으로 변하는 지 여부를 확인하여 테스트 할 수 있습니다. 이 시험 후, ONPG와의 특이 적 상호 작용을위한 420 nm에서의 시료 및 Bradford Assay에 대한 595에서의 정량은 양적으로 평가 될 수있다. 이 분광 광도계 이외에 다양한 단백질 샘플을 정제하고 분리하기 위해 SDS-Page 전기 영동과 같은 다른 기술과 함께 사용할 수 있습니다.
IR 분광 광도계
적외선 영역을 위해 설계된 분광 광도계는 해당 지역의 측정에 대한 기술적 요구 사항 때문에 상당히 다릅니다. 하나의 주요 요소는 서로 다른 스펙트럼 영역에서 사용할 수있는 포토 센서의 유형이지만 적외선 측정은 열 방사, 특히 약 5 μm 이상의 파장에서 거의 모든 것이 적외선을 방출하기 때문에 도전적입니다.
또 다른 합병증은 유리와 플라스틱과 같은 상당수의 물질이 적외선을 흡수하여 광학 매체와 호환되지 않는다는 것입니다. 이상적인 광학 재료는 강하게 흡수하지 않는 염입니다. 적외선 분광 광도계를위한 샘플은 브롬화 칼륨 또는 브롬화 칼륨으로 분쇄 된 두 개의 디스크 사이에 번짐으로써 펠렛 내로 압착 될 수있다. 수용액을 측정 할 때는 불용성 염화은을 사용하여 세포를 만든다.
분광 방사 측정기
가시 영역 분광 광도계와 거의 비슷하게 작동하는 분광 방사 계는 광원의 스펙트럼 밀도를 측정하도록 설계되었습니다. 응용 프로그램에는 제조업체의 판매 조명에 대한 평가 및 분류 또는 고객이 구입하기로 결정한 램프가 사양에 맞는지 확인할 수있는 기능이 포함될 수 있습니다. 구성 요소 :
광원은 샘플 위 또는 샘플을 통해 빛난다.
샘플은 빛을 전송하거나 반사합니다.
검출기는 샘플에서 반사되거나 반사 된 빛의 양을 감지합니다.
그런 다음 탐지기는 샘플을 전송하거나 반사 한 빛의 양을 숫자로 변환합니다.