Espectrofotometria

Em química, a espectrofotometria é a medida quantitativa das propriedades de reflexão ou transmissão de um material em função do comprimento de onda. É mais específico que o termo geral espectroscopia eletromagnética nessa espectrofotometria lida com a luz visível, quase ultravioleta e infravermelho próximo, mas não cobre técnicas espectroscópicas resolvidas no tempo.

Visão geral
A espectrofotometria é uma ferramenta que depende da análise quantitativa de moléculas, dependendo da quantidade de luz absorvida pelos compostos coloridos. A espectrofotometria utiliza fotômetros, conhecidos como espectrofotômetros, que podem medir a intensidade de um feixe de luz em função de sua cor (comprimento de onda). As características importantes dos espectrofotômetros são a largura de banda espectral (a faixa de cores que pode transmitir através da amostra de teste), a porcentagem de transmissão de amostra, a faixa logarítmica de absorção de amostra e, às vezes, uma porcentagem de medição de refletância.

Um espectrofotômetro é comumente usado para a medição de transmitância ou refletância de soluções, sólidos transparentes ou opacos, como vidro polido ou gases. Embora muitos compostos bioquímicos sejam coloridos, absorvem a luz visível e, portanto, podem ser medidos por procedimentos colorimétricos, mesmo compostos bioquímicos incolores podem ser convertidos em compostos coloridos adequados para reações cromogênicas de formação de cor para produzir compostos adequados para análise colorimétrica. No entanto, eles também podem ser projetados para medir a difusividade em qualquer um dos intervalos de luz listados que geralmente cobrem em torno de 200 nm – 2500 nm usando diferentes controles e calibrações. Dentro dessas faixas de luz, são necessárias calibrações na máquina usando padrões que variam dependendo do comprimento de onda da determinação fotométrica.

Um exemplo de experimento em que a espectrofotometria é usada é a determinação da constante de equilíbrio de uma solução. Uma certa reação química dentro de uma solução pode ocorrer em uma direção direta e reversa, onde os reagentes formam produtos e produtos que se decompõem em reagentes. Em algum momento, essa reação química alcançará um ponto de equilíbrio chamado ponto de equilíbrio. A fim de determinar as respectivas concentrações de reagentes e produtos neste ponto, a transmitância da luz da solução pode ser testada usando espectrofotometria. A quantidade de luz que passa pela solução é indicativa da concentração de certas substâncias químicas que não permitem a passagem da luz.

A absorção da luz é devida à interação da luz com os modos eletrônico e vibracional das moléculas. Cada tipo de molécula tem um conjunto individual de níveis de energia associados à composição de suas ligações e núcleos químicos, e assim absorverá a luz de comprimentos de onda específicos, ou energias, resultando em propriedades espectrais únicas. Isto é baseado em sua composição específica e distinta.

O uso de espectrofotômetros abrange vários campos científicos, como física, ciência dos materiais, química, bioquímica e biologia molecular. Eles são amplamente utilizados em muitas indústrias, incluindo semicondutores, fabricação de laser e óptica, impressão e exame forense, bem como em laboratórios para o estudo de substâncias químicas. A espectrofotometria é freqüentemente usada em medições de atividades enzimáticas, determinações de concentrações protéicas, determinações de constantes cinéticas enzimáticas e medidas de reações de ligação de ligantes. Em última análise, um espectrofotômetro é capaz de determinar, dependendo do controle ou calibração, quais substâncias estão presentes em um alvo e exatamente quanto através de cálculos de comprimentos de onda observados.

Em astronomia, o termo espectrofotometria refere-se à medição do espectro de um objeto celeste no qual a escala de fluxo do espectro é calibrada em função do comprimento de onda, geralmente por comparação com uma observação de uma estrela padrão espectrofotométrica, e corrigida para a absorção de luz pela atmosfera da Terra.

História
Em 1940, vários espectrofotômetros estavam disponíveis no mercado, mas os primeiros modelos não funcionavam no ultravioleta. Arnold O. Beckman desenvolveu uma versão melhorada na National Technical Laboratories Company, mais tarde na Beckman Instrument Company e, por fim, na Beckman Coulter. Os modelos A, B e C foram desenvolvidos (três unidades do modelo C foram produzidas), depois o modelo D, que se tornou DU. Todos os componentes eletrônicos estavam contidos dentro do estojo do instrumento, e ele tinha uma nova lâmpada de hidrogênio com continuidade ultravioleta e um melhor monocromador. Este instrumento foi produzido de 1941 até 1976 com essencialmente o mesmo design; mais de 30.000 foram vendidos. O preço de 1941 era de US $ 723 (os acessórios UV distantes eram uma opção com custo adicional). O Prêmio Nobel de Química Bruce Merrifield disse que foi “provavelmente o instrumento mais importante já desenvolvido para o avanço da biociência”.

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Existem duas classes principais de dispositivos: feixe único e feixe duplo. Um espectrofotômetro de feixe duplo compara a intensidade da luz entre dois caminhos de luz, um caminho contendo uma amostra de referência e o outro a amostra de teste. Um espectrofotômetro de feixe único mede a intensidade de luz relativa do feixe antes e depois de uma amostra de teste ser inserida. Embora as medições de comparação de instrumentos de feixe duplo sejam mais fáceis e mais estáveis, os instrumentos de feixe único podem ter uma faixa dinâmica maior e são opticamente mais simples e mais compactos. Além disso, alguns instrumentos especializados, como espectrofotômetros construídos em microscópios ou telescópios, são instrumentos de feixe único devido à praticidade.

Historicamente, os espectrofotômetros usam um monocromador contendo uma grade de difração para produzir o espectro analítico. A grade pode ser móvel ou fixa. Se um único detector, como um fotomultiplicador ou fotodiodo, for usado, a grade pode ser digitalizada em etapas, de modo que o detector possa medir a intensidade da luz em cada comprimento de onda (que corresponderá a cada “etapa”). Matrizes de detectores, como dispositivos de carga acoplada (CCD) ou matrizes de fotodíodos (PDA) também podem ser usados. Em tais sistemas, a grade é fixa e a intensidade de cada comprimento de onda da luz é medida por um detector diferente na matriz. Além disso, a maioria dos espectrofotômetros de infravermelho médio usa uma técnica de transformada de Fourier para adquirir a informação espectral. Essa técnica é chamada de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier.

Ao fazer medições de transmissão, o espectrofotômetro compara quantitativamente a fração de luz que passa por uma solução de referência e uma solução de teste, então compara eletronicamente as intensidades dos dois sinais e calcula a porcentagem de transmissão da amostra comparada ao padrão de referência. Para medições de refletância, o espectrofotômetro compara quantitativamente a fração de luz que reflete a partir das amostras de referência e teste. A luz da lâmpada de origem é passada através de um monocromador, que difrata a luz em um “arco-íris” de comprimentos de onda através de um prisma rotativo e gera larguras de banda estreitas desse espectro difratado através de uma fenda mecânica no lado de saída do monocromador. Essas larguras de banda são transmitidas através da amostra de teste. Em seguida, a densidade de fluxo de fótons (watts por metro quadrado geralmente) da luz transmitida ou refletida é medida com um fotodiodo, dispositivo de carga acoplada ou outro sensor de luz. O valor de transmitância ou de reflectância para cada comprimento de onda da amostra de teste é então comparado com os valores de transmissão ou reflectância da amostra de referência. A maioria dos instrumentos aplicará uma função logarítmica à taxa de transmissão linear para calcular a “absorvência” da amostra, um valor que é proporcional à “concentração” do produto químico a ser medido.

Em resumo, a sequência de eventos em um espectrofotômetro moderno é a seguinte:

A fonte de luz é projetada em um monocromador, difratada em um arco-íris e dividida em dois feixes. É então escaneado através da amostra e das soluções de referência.
As frações dos comprimentos de onda incidentes são transmitidas ou refletidas a partir da amostra e da referência.
A luz resultante atinge o dispositivo fotodetector, que compara a intensidade relativa dos dois feixes.
Os circuitos eletrônicos convertem as correntes relativas em porcentagens de transmissão linear e / ou valores de absorbância / concentração.
Muitos espectrofotômetros antigos devem ser calibrados por um procedimento conhecido como “zerar”, para equilibrar a saída de corrente nula dos dois feixes no detector. A transmissão de uma substância de referência é definida como um valor de referência (datum), de modo que a transmissão de todas as outras substâncias é registrada em relação à substância inicial “zerada”. O espectrofotômetro então converte a relação de transmissão em ‘absorvência’, a concentração de componentes específicos da amostra de teste em relação à substância inicial.

Aplicações em bioquímica
A espectrofotometria é uma técnica importante usada em muitos experimentos bioquímicos que envolvem isolamento de DNA, RNA e proteínas, cinética enzimática e análises bioquímicas. Uma breve explicação do procedimento de espectrofotometria inclui a comparação da absorção de uma amostra em branco que não contém um composto colorido a uma amostra que contém um composto colorido. Esta coloração pode ser conseguida por um corante tal como o corante Coomasie Brilliant Blue G-250 medido a 595 nm ou por uma reacção enzimática como se vê entre a p-galactosidase e a ONPG (transforma a amostra amarela) medida a 420 nm. O espectrofotômetro é usado para medir compostos coloridos na região visível da luz (entre 350 nm e 800 nm), assim ele pode ser usado para encontrar mais informações sobre a substância em estudo. Em experimentos bioquímicos, uma propriedade química e / ou física é escolhida e o procedimento usado é específico para essa propriedade, a fim de obter mais informações sobre a amostra, como quantidade, pureza, atividade enzimática, etc. Espectrofotometria pode ser usada para várias técnicas, como determinar a absorbância de comprimento de onda ideal das amostras, determinar o pH ótimo para a absorção das amostras, determinar as concentrações de amostras desconhecidas e determinar o pKa de várias amostras. A espectrofotometria também é um processo útil para a purificação de proteínas e também pode ser usado como um método para criar ensaios ópticos de um composto. Dados espectrofotométricos também podem ser usados ​​em conjunto com a Equação de Beer-Lambert, A = -log10T = εcl = OD, para determinar várias relações entre transmitância e concentração, e absorbância e concentração. Como um espectrofotômetro mede o comprimento de onda de um composto através de sua cor, uma substância de ligação de corante pode ser adicionada para que possa sofrer uma alteração de cor e ser medida. É possível conhecer as concentrações de uma mistura de dois componentes usando os espectros de absorção das soluções padrão de cada componente. Para isso, é necessário conhecer o coeficiente de extinção dessa mistura em dois comprimentos de onda e os coeficientes de extinção de soluções que contêm os pesos conhecidos dos dois componentes. Os espectrofotômetros foram desenvolvidos e aprimorados ao longo de décadas e têm sido amplamente utilizados entre os químicos. Além disso, os espectrofotômetros são especializados para medir os valores de absorbância de comprimento de onda da luz UV ou visível. É considerado um instrumento altamente preciso que também é muito sensível e, portanto, extremamente preciso, especialmente na determinação da mudança de cor. Este método também é conveniente para uso em experimentos de laboratório, porque é um processo relativamente simples e barato.

Espectrofotometria UV-visível
A maioria dos espectrofotômetros é usada nas regiões UV e visível do espectro, e alguns desses instrumentos também operam na região do infravermelho próximo. A concentração de uma proteína pode ser estimada medindo a DO a 280 nm devido à presença de triptofano, tirosina e fenilalanina. Este método não é muito preciso, pois a composição das proteínas varia muito e as proteínas com nenhum desses aminoácidos não têm absorção máxima a 280 nm. A contaminação por ácido nucleico também pode interferir. Este método requer um espectrofotômetro capaz de medir na região UV com cubetas de quartzo.

A espectroscopia ultravioleta-visível (UV-vis) envolve níveis de energia que estimulam as transições eletrônicas. Absorção de luz UV-vis excita moléculas que estão nos estados fundamentais para seus estados excitados

A região visível de espectrofotometria de 400 a 700 nm é usada extensivamente na ciência da colorimetria. É um fato conhecido que opera melhor na faixa de 0,2-0,8 fabricantes de tinta OD, empresas de impressão, fornecedores de têxteis e muitos mais, precisam dos dados fornecidos através de colorimetria. Eles fazem leituras na região de cada 5 a 20 nanômetros ao longo da região visível e produzem uma curva de refletância espectral ou um fluxo de dados para apresentações alternativas. Essas curvas podem ser usadas para testar um novo lote de corante para verificar se ele corresponde às especificações, por exemplo, padrões de impressão ISO.

Espectrofotômetros de região visível tradicional não podem detectar se um corante ou o material de base tem fluorescência. Isso pode dificultar o gerenciamento de problemas de cores se, por exemplo, uma ou mais das tintas de impressão forem fluorescentes. Quando um corante contém fluorescência, é utilizado um espectrofotómetro fluorescente bi-espectral. Existem duas configurações principais para espectrofotômetros de espectro visual, d / 8 (esférico) e 0/45. Os nomes são devidos à geometria da fonte de luz, observador e interior da câmara de medição. Os cientistas usam este instrumento para medir a quantidade de compostos em uma amostra. Se o composto for mais concentrado, mais luz será absorvida pela amostra; dentro de pequenas faixas, a lei de Beer-Lambert se mantém e a absorbância entre as amostras varia com a concentração linear. No caso de medições de impressão, duas configurações alternativas são comumente usadas – sem / com filtro UV para controlar melhor o efeito de abrilhantadores UV dentro do estoque de papel.

As amostras são geralmente preparadas em cubetas; dependendo da região de interesse, eles podem ser construídos de vidro, plástico (região do espectro visível de interesse) ou quartzo (região de interesse do espectro UV distante).

Aplicações
Estimativa da concentração de carbono orgânico dissolvido
Absorção ultravioleta específica para métrica de aromaticidade
Teste de Bial para concentração de pentoses
Aplicação Experimental
Conforme descrito na seção de aplicações, a espectrofotometria pode ser usada na análise qualitativa e quantitativa de DNA, RNA e proteínas. Análises qualitativas podem ser usadas e espectrofotômetros são usados ​​para registrar espectros de compostos por varredura de regiões de comprimentos de onda para determinar as propriedades de absorbância (a intensidade da cor) do composto em cada comprimento de onda. Um experimento que pode demonstrar os vários usos que a espectrofotometria visível pode ter é a separação de β-galactosidase de uma mistura de várias proteínas. Em grande parte, a espectrofotometria é melhor usada para ajudar a quantificar a quantidade de purificação que sua amostra sofreu em relação à concentração total de proteína. Ao executar uma cromatografia de afinidade, você pode isolar a B-galactosidase e isso pode ser testado pela reação das amostras coletadas com o ONPG e determinar se a amostra fica amarela. Após este teste, a amostra a 420 nm para interação específica com ONPG e a 595 para um ensaio de Bradford, a quantidade de purificação pode ser avaliada quantitativamente. Além desta espectrofotometria pode ser usado em conjunto com outras técnicas, como a eletroforese SDS-Page, a fim de purificar e isolar várias amostras de proteínas.

Espectrofotometria de infravermelho
Os espectrofotômetros projetados para a região do infravermelho são bastante diferentes devido aos requisitos técnicos de medição nessa região. Um fator importante é o tipo de fotossensores que estão disponíveis para diferentes regiões espectrais, mas a medição de infravermelho também é um desafio, porque praticamente tudo emite luz infravermelha como radiação térmica, especialmente em comprimentos de onda superiores a 5 μm.

Outra complicação é que vários materiais, como vidro e plástico, absorvem a luz infravermelha, tornando-a incompatível como um meio óptico. Materiais ópticos ideais são sais, que não absorvem fortemente. As amostras para espectrofotometria de IV podem ser borradas entre dois discos de brometo de potássio ou moídas com brometo de potássio e prensadas em um sedimento. Quando se pretende medir soluções aquosas, utiliza-se cloreto de prata insolúvel para construir a célula.

Espectrorradiômetros
Os espectrorradiômetros, que operam quase como os espectrofotômetros da região visível, são projetados para medir a densidade espectral dos iluminantes. As aplicações podem incluir avaliação e categorização de iluminação para vendas pelo fabricante, ou para os clientes confirmarem que a lâmpada que eles decidiram comprar está dentro de suas especificações. Componentes:

A fonte de luz brilha na ou através da amostra.
A amostra transmite ou reflete a luz.
O detector detecta quanta luz foi refletida ou transmitida através da amostra.
O detector então converte a quantidade de luz que a amostra transmitiu ou refletiu em um número.